p16基因的不同转染方法对脑胶质瘤细胞的不同作用
作者：陈一招 徐如祥 张世忠 邹玲
单位：陈一招(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州 510282)；徐如祥(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州 510282)；张世忠(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州 510282)；邹玲(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州 510282)
关键词：脑胶质瘤；p16基因；基因转染
癌症000205
【摘 要】目的：探索p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用。方法：分别采用脂质体、磷酸钙+DMSO休克转染的方法，观察外源野生型p16基因短暂转染与长期稳定转染对人胶质瘤细胞系U251、SWO的作用，并筛选阳性克隆。同时以空载体质粒PCDNA3为对照。免疫组化、Northern杂交检测p16基因表达，对转染后细胞生长、细胞周期及细胞凋亡的变化进行分析。结果：p16基因短暂转染有明显的凋亡诱导作用；而p16基因长期稳定转染无明显的凋亡诱导作用，但外源p16基因的高水平表达显著抑制了胶质瘤U251、SWO细胞的生长，克隆形成率减少，肿瘤细胞发生了G1期阻滞。结论：外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖并诱导细胞凋亡。肿瘤细胞的异质性特点与p16基因转染后的“自然选择”作用可能是p16基因长期稳定转染无明显凋亡诱导作用的主要机制。
, 百拇医药
中图分类号：R730.5 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)02-0116-05
Different effects of p16 gene on human glioma cell lines through different transfection methods
CHEN Yi-zhao XU Ru-xiang ZHANG Shi-zhong et al
(Neurosurgery Department,Zhuj iang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510828,P.R.China)
【Abstract】 Objective:To determine the effect on the cell growth and apoptosis of CDK4I/p16 in human glioma cell lines.Methods:p16 gene was transfected into U251 and SWO cells by utilizing the methods of lipofectin or calcium phosphate co precipitation. Expression of exogenous p16 gene was confirmed by immunohistochemistry and Northern blot analysis. The effects of transient or stable expression of exogenous p16 gene on the growth of U251 and SWO cells were examined in vitro. Results:The transient expression of exogenous p16 gene induced apoptosis of the glioma cells,while the stable transfection of p16 gene did not. However, stable expression of exogenous p16 gene could inhibit cell growth dramatically and cloning efficiencies of the two cell lines were reduced as well. G1 arrest of the tumor cells was observed. Conclusions: The expression of exogenous p16 gene could inhibit malignant growth of glioma cells and induce apoptosis.The reasons for the difference between the effects on apoptosis of transient and stable transfection of p16 gene might be the heterogenicity of the tumor cells and the “ selection” by the gene transfection.
, 百拇医药
Key Words：Glioma; p16 gene; Gene transfection
p16基因(MTS1,CDK4I,CDKN2)是近年发现的一个新的抑癌基因，是细胞周期调控基因家族中的重要成员，其主要作用机制是直接抑制细胞周期。在多种肿瘤细胞系及临床肿瘤标本中，p16基因都有着高频率的缺失及突变，尤其以脑胶质瘤细胞为最高，达71%～82%[1，2]，显示了它在脑胶质瘤恶性转化中的重要作用。因此研究p16基因对脑胶质瘤的作用，对于提高未来脑胶质瘤诊断治疗水平具有重要意义。然而，从p16基因发现到目前为止，p16基因与脑胶质瘤细胞凋亡间的关系却鲜有文献报道。本文通过短暂转染与长期稳定转染的不同方法分别将外源p16基因导入人胶质瘤细胞系U251、SWO，观察到p16基因短暂表达与长期稳定表达对胶质瘤细胞有不同的作用，并提出可能的遗传学机制。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 细胞系
p16基因纯合性缺失的U251人胶质瘤细胞系、SWO人胶质瘤细胞系。U251细胞用含10%小牛血清的DMEM高糖培养基培养，为本实验室常规保存。SWO细胞系用含10%小牛血清的RPMI1640培养基培养，由张健博士惠赠。
1.2 质粒
人PCDNA3-neo-p16由国立日本香川医科大学脑神经外科惠赠。空PCDNA3载体质粒由本实验室常规保存。
1.3 抗体
鼠抗p16单克隆抗体购自武汉博士德公司。免疫组化ABC试剂盒为VECTOR产品。
1.4 试剂
G418购自Amersham公司；DMEM、lipofectin为GIBCO BRL Life Technologies产品；MTT、PI购自Sigma公司。MTT溶于0.01MPBS中，终浓度5mg/ml，4℃避光保存。DMSO为Farco产品。
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1.5 细胞的短暂转染及长期稳定转染与筛选
细胞短暂转染采用磷酸钙+DMSO休克的方法[3]。常规等量磷酸钙-DNA转染后，加入含10%DMSO培养液孵育3分钟，提高转染效率。细胞的长期稳定转染采用脂质体lipofectin(GIBCO)的方法，将经分光光度计定量的等量质粒转染各细胞。500μg/mlG418筛选8周。以上均设立空PCDNA3质粒转染对照组。
1.6 免疫组织化学
采用ABC法。
1.7 Northern杂交分析
提取各转染筛选细胞系的总RNA。经分光光度计定量后，取20μg总RNA样品行甲醛变性的凝胶电泳，真空转膜，按BOEHRINGER MANNHEIM的程序进行探针DIG标记及Northern blotting。
, 百拇医药
1.8 细胞生长曲线的测定
按郝新保的方法[4]，采用MTT法绘制细胞生长曲线。
1.9 流式细胞仪分析
按INicoletti的方法，常规消化各细胞系后，400目网过滤，200g离心后将细胞重悬于PI染液中(PI50μg/ml，0.1%柠檬酸钠，0.1%TritonX-100)，避光4℃过夜后上机检测[5]。
1.10 细胞DNA片段化分析
收集经p16基因、PCDNA3空质粒磷酸钙-DMSO转染后48小时的细胞，用DNAzol(GIBCO)试剂提取基因组DNA。乙醇沉淀后，用20μlTE溶解DNA，1%琼脂糖电泳。
1.11 统计学分析
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曲线之间的比较采用方差分析。各细胞周期分布的比较采用t检验。n值为各组实验数。
2 结果
2.1 表达p16基因的胶质瘤细胞系U251、SWO的长期稳定转染和筛选
用lipofectin脂质体转染的方法分别将经分光光度计定量后的等量PCDNA3-p16及空质粒转入SWO及U251细胞系，经500μg/mlG418的筛选。加药约7天后，大部分细胞死亡。14天后，转染PCDNA3空质粒的SWO、U251细胞组开始出现克隆，26天后，p16基因转染的两细胞组才开始有克隆形成，且p16基因转染组的克隆形成数目明显少于空PCDNA3质粒转染组。筛选5周后，从每株细胞中挑取2～4个克隆进行单克隆化，经Northern-Blotting检测筛选高表达克隆。
2.2 转染后外源p16基因的表达
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p16基因免疫组化示经p16基因磷酸钙-DMSO转染的细胞系阳性细胞数明显增多(图1)。图2示经G418筛选的长期稳定转染p16基因的U251细胞免疫组化呈强阳性，对照组呈阴性或弱阳性。Northern blotting分析示U251-p16与SWO-p16细胞p16基因表达水平明显高于对照组(图3)。
图1 磷酸钙-DMSO转染后P16基因的免疫组化(DAB显色,苏木素复染)
A.转染PCDNA3空质粒的U251对照细胞B.转染p16基因的U251细胞
, 百拇医药
图2 U251细胞稳定转染筛选后的免疫组化(DAB显色，苏木素复染)
A.转染PCDNA3空质粒的U251对照细胞B.转染p16基因的U251-p16细胞
图3p16基因、PCDNA3空质粒转染后U251的
Northern blot分析
1:U251-p16;2:U251-p16；3:p16转染48h的U251;
4:U251-PCDNA3;5:U251
2.3 p16基因磷酸钙-DMSO转染后对胶质瘤细胞凋亡的诱导作用
, 百拇医药
U251、SWO细胞经p16基因短暂转染48小时后，光镜下可见部分细胞变圆，部分细胞脱落死亡；对照组细胞无明显变化。行流式细胞仪分析，可见p16基因转染48小时后出现明显的亚G1峰(即凋亡峰)(图4)。提取该细胞DNA行琼脂糖电泳，发现有典型的DNA ladder现象。这些结果表明p16基因的短暂转染可诱导胶质瘤细胞U251、SWO的凋亡。同时行流式细胞仪细胞周期分析，其中，SWO细胞系各期分布无明显差异(P>0.05)(表1)。
图4SWO,U251细胞系p16基因磷酸钙-DMSO转染后流式细胞仪分析(PI染色)
A.SWO-PCDNA3;B.SWO-p16;E.U251-PCDNA3;H.U251-p16
表1 SWO细胞系p16基因磷酸钙-DMSO转染后
, 百拇医药
流式细胞仪细胞周期分析(n=10，
±s) 细胞系
G1期(%)
G2期(%)
S期(%)
SWO-PCDNA3
55.2±4.7
12.3±2.5
32.5±5.1
SWO-p16
58.0±6.2
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10.2±3.7
31.8±6.0
t检验，P>0.05
2.4 外源p16基因长期稳定表达对U251、SWO细胞的抑制作用
图5A、B分别显示U251-p16(+)和SWO-p16(+)与SWO、U251亲代及分别转染PCDNA3空质粒的SWO、U251细胞系相比，生长速度明显减慢。行流式细胞仪分析，可见p16基因转染的胶质瘤细胞系二倍体峰后细胞及四倍体细胞明显减少，无明显的亚G1峰(凋亡峰)。细胞周期分析提示p16基因转染后胶质瘤G1/G0期细胞比例明显增加(P<0.01)(表2)。
, http://www.100md.com 图5 A p16基因表达对脑胶质瘤细胞系U251生长的影响
图5 B p16基因表达对脑胶质瘤细胞系SWO生长的影响
(两细胞系的p16转染组与PCDNA3对照组及母细胞系组分别
从第五、六天始出现有统计意义的差异，F检验，P<0.01；PCDNA3
对照组与母细胞系组在实验全程的差异均无统计意义，F检验，P>0.05。n=12)
表2 U251细胞系p16基因长期稳定转染后
流式细胞仪细胞周期分析(n=10,±s) 细胞系
, 百拇医药
G1期(%)
G2期(%)
S期(%)
U251-PCDNA3
69.8±3.1
12.3±2.9
19.9±2.2
U251-p16
85.5±4.4
0.3±0.2
14.2±3.4
, 百拇医药 t检验，P<0.01
3 讨论
p16基因是目前脑胶质瘤研究中所发现的缺失率、突变率最高的基因。据统计，在目前所研究的胶质瘤细胞株中，p16缺失率达82%[1]，而在原发性脑胶质瘤中也高达71%[2]，充分显示了p16基因异常与脑胶质瘤发生发展的密切关系，并引起了人们的高度重视。目前认为，p16基因的主要作用是特异性的抑制细胞周期素D(cyclin D)-细胞周期素依赖性激酶(CDK)复合体，从而达到对细胞由G1期到S期的调控。当细胞由于某种原因p16基因缺失或失活，cyclin D-CDK复合体持续高活性的存在于细胞内，进而导致pRb基因的磷酸化，从而释放转录因子E2F等，从而激活其他细胞增殖相关基因，导致细胞从G1期到S期的不受控特性[6]。本实验将p16基因通过长期稳定转染导入胶质瘤细胞株U251、SWO，结果两者的生长速度明显减慢，肿瘤细胞被阻滞在G1/G0期，充分证实了野生型p16基因能抑制肿瘤生长，其缺失及突变可导致细胞的恶性增殖。但为什么在短暂转染后的细胞周期分析却无统计意义呢？我们认为，其主要原因在于短暂转染的转染效率问题。一般来说，普通磷酸钙转染的效率最高达10%[3]，当采用DMSO休克后，虽可使转染效率急剧升高，但也较难达到50%以上。因此，相当一部分细胞不被p16基因转染。当我们取P=0.05作为判别标准，在小样本情况下，有时难以获得有统计意义的结果。
, 百拇医药
目前，有关p16基因与胶质瘤细胞凋亡的关系尚未见文献报道。我们认为，这可能与大多数研究者将研究重点放在p16基因的长期稳定转染进而研究p16基因对这些阳性克隆的作用有关。事实上，我们发现，p16基因的短暂转染与长期稳定转染的作用各有其不同侧重。p16基因短暂转染可诱导明显的细胞凋亡，但由于转染效率的限制，部分细胞系的G1/G0期阻滞不明显；而p16基因的长期稳定转染有明显的肿瘤细胞G1/G0期阻滞和细胞生长抑制，但无明显的细胞凋亡现象。这是一个饶有兴趣的问题。我们认为，p16基因的作用很可能不仅仅是特异性的抑制cyclin D-CDK复合体。在复杂的人体“基因网络”中，p16基因很可能能与其他基因相互作用，共同参与细胞凋亡调控等其他生命现象。单基因、单作用是不符合大多数生命现象调控本质的，尤其是真核高等生命。在这方面，Sandig等报道了与我们类似的结果[7]。他们发现，当p16基因与p53联合作用后，细胞凋亡发生率大大提高，他们认为，这是p16基因降低Rb的表达进而增加肿瘤细胞对凋亡敏感性的结果。同时，程金科等也发现，采用腺病毒载体将基因短暂转染黑色素瘤细胞可诱导明显的细胞凋亡[8]。然而，为什么会出现肿瘤细胞短暂转染与长期稳定转染的差异呢？我们知道，异质性是肿瘤尤其是恶性肿瘤的一个重要特点。它不仅表现在肿瘤细胞形态上，同时，由于肿瘤细胞的高度恶性增殖，更赋予肿瘤细胞在遗传学上的不稳定特点。即使在同一肿瘤细胞系或同一原发性肿瘤，在其恶性增殖过程中，最终它们的基因型不一定完全一致，这就是肿瘤细胞异质性的遗传学基础，也是临床病理上各种混合型肿瘤发生的原因之一。从进化论的角度来看，当p16基因转染入一个肿瘤细胞群体后，能被p16基因诱导凋亡的肿瘤细胞发生了凋亡，被“淘汰”；而不能被p16基因诱导凋亡的肿瘤细胞仍能继续存活下来，被“选择”，最终成为一个稳定整合p16基因的肿瘤细胞系，在这一“新”细胞系中，p16基因已不能发挥诱导细胞凋亡的作用但仍能发挥它的基本功能即：抑制cyclin D-CDK复合体、诱导肿瘤细胞的G1期阻滞。
, 百拇医药
人体的基因调控是一个非常复杂的网络系统。p16基因也是如此。我们觉得，我们目前所了解的有关p16基因的作用与调控仍仅仅是沧海一粟。进一步深入胶质瘤p16基因研究并结合正常胶质细胞的p16基因研究将具有重大意义。p16基因的变化直接与人类50%～70%的胶质瘤患者密切相关，如何将单一基因置于复杂的基因网络中研究可能是我们的当务之急。也是我们未来基因研究的方向，当然，这一过程不是一蹴而就的，需要广大研究者的协作与共同努力。我们相信，随着人类对自身基因网络调控的深入了解，必将开辟肿瘤诊断、治疗的新局面，最终攻克肿瘤。
基金项目：本课题受国家自然科学基金(批准号:39700143)资助
通讯作者：徐如祥：Tel：86-20-85143622
Fax：86-20-84309130
E-mail：chenyizhao@163.net
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[参考文献]
[1] Kamb A， Gruis NA, Wearer-Feldhaus J,et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types [J]. Science,1994,15:264(5157):436～440.
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[3] 奥斯伯 F，金斯顿 RE，赛德曼 JG，等，编著.颜子颖，王海林，译.精编分子生物学实验指南[M].第一版.北京：科学出版社，1998：274.
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[7] Sandig V,Brand K，Herwig S,et al. Adenovirally transferred p16INK/CDK2 and p53 genes cooperate to induce apoptotic tumor cell death [J]. Nat Med,1997,3:313～319.
[8]程金科，林晨.腺病毒介导p16基因转移及诱导黑色素瘤细胞凋亡[J].中华肿瘤杂志,1999,21(2)：89～91.
收稿日期：1999-07-05；修回日期：1999-09-28, http://www.100md.com
单位：陈一招(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州 510282)；徐如祥(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州 510282)；张世忠(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州 510282)；邹玲(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州 510282)
关键词：脑胶质瘤；p16基因；基因转染
癌症000205
【摘 要】目的：探索p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用。方法：分别采用脂质体、磷酸钙+DMSO休克转染的方法，观察外源野生型p16基因短暂转染与长期稳定转染对人胶质瘤细胞系U251、SWO的作用，并筛选阳性克隆。同时以空载体质粒PCDNA3为对照。免疫组化、Northern杂交检测p16基因表达，对转染后细胞生长、细胞周期及细胞凋亡的变化进行分析。结果：p16基因短暂转染有明显的凋亡诱导作用；而p16基因长期稳定转染无明显的凋亡诱导作用，但外源p16基因的高水平表达显著抑制了胶质瘤U251、SWO细胞的生长，克隆形成率减少，肿瘤细胞发生了G1期阻滞。结论：外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖并诱导细胞凋亡。肿瘤细胞的异质性特点与p16基因转染后的“自然选择”作用可能是p16基因长期稳定转染无明显凋亡诱导作用的主要机制。
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中图分类号：R730.5 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)02-0116-05
Different effects of p16 gene on human glioma cell lines through different transfection methods
CHEN Yi-zhao XU Ru-xiang ZHANG Shi-zhong et al
(Neurosurgery Department,Zhuj iang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510828,P.R.China)
【Abstract】 Objective:To determine the effect on the cell growth and apoptosis of CDK4I/p16 in human glioma cell lines.Methods:p16 gene was transfected into U251 and SWO cells by utilizing the methods of lipofectin or calcium phosphate co precipitation. Expression of exogenous p16 gene was confirmed by immunohistochemistry and Northern blot analysis. The effects of transient or stable expression of exogenous p16 gene on the growth of U251 and SWO cells were examined in vitro. Results:The transient expression of exogenous p16 gene induced apoptosis of the glioma cells,while the stable transfection of p16 gene did not. However, stable expression of exogenous p16 gene could inhibit cell growth dramatically and cloning efficiencies of the two cell lines were reduced as well. G1 arrest of the tumor cells was observed. Conclusions: The expression of exogenous p16 gene could inhibit malignant growth of glioma cells and induce apoptosis.The reasons for the difference between the effects on apoptosis of transient and stable transfection of p16 gene might be the heterogenicity of the tumor cells and the “ selection” by the gene transfection.
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Key Words：Glioma; p16 gene; Gene transfection
p16基因(MTS1,CDK4I,CDKN2)是近年发现的一个新的抑癌基因，是细胞周期调控基因家族中的重要成员，其主要作用机制是直接抑制细胞周期。在多种肿瘤细胞系及临床肿瘤标本中，p16基因都有着高频率的缺失及突变，尤其以脑胶质瘤细胞为最高，达71%～82%[1，2]，显示了它在脑胶质瘤恶性转化中的重要作用。因此研究p16基因对脑胶质瘤的作用，对于提高未来脑胶质瘤诊断治疗水平具有重要意义。然而，从p16基因发现到目前为止，p16基因与脑胶质瘤细胞凋亡间的关系却鲜有文献报道。本文通过短暂转染与长期稳定转染的不同方法分别将外源p16基因导入人胶质瘤细胞系U251、SWO，观察到p16基因短暂表达与长期稳定表达对胶质瘤细胞有不同的作用，并提出可能的遗传学机制。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 细胞系
p16基因纯合性缺失的U251人胶质瘤细胞系、SWO人胶质瘤细胞系。U251细胞用含10%小牛血清的DMEM高糖培养基培养，为本实验室常规保存。SWO细胞系用含10%小牛血清的RPMI1640培养基培养，由张健博士惠赠。
1.2 质粒
人PCDNA3-neo-p16由国立日本香川医科大学脑神经外科惠赠。空PCDNA3载体质粒由本实验室常规保存。
1.3 抗体
鼠抗p16单克隆抗体购自武汉博士德公司。免疫组化ABC试剂盒为VECTOR产品。
1.4 试剂
G418购自Amersham公司；DMEM、lipofectin为GIBCO BRL Life Technologies产品；MTT、PI购自Sigma公司。MTT溶于0.01MPBS中，终浓度5mg/ml，4℃避光保存。DMSO为Farco产品。
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1.5 细胞的短暂转染及长期稳定转染与筛选
细胞短暂转染采用磷酸钙+DMSO休克的方法[3]。常规等量磷酸钙-DNA转染后，加入含10%DMSO培养液孵育3分钟，提高转染效率。细胞的长期稳定转染采用脂质体lipofectin(GIBCO)的方法，将经分光光度计定量的等量质粒转染各细胞。500μg/mlG418筛选8周。以上均设立空PCDNA3质粒转染对照组。
1.6 免疫组织化学
采用ABC法。
1.7 Northern杂交分析
提取各转染筛选细胞系的总RNA。经分光光度计定量后，取20μg总RNA样品行甲醛变性的凝胶电泳，真空转膜，按BOEHRINGER MANNHEIM的程序进行探针DIG标记及Northern blotting。
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1.8 细胞生长曲线的测定
按郝新保的方法[4]，采用MTT法绘制细胞生长曲线。
1.9 流式细胞仪分析
按INicoletti的方法，常规消化各细胞系后，400目网过滤，200g离心后将细胞重悬于PI染液中(PI50μg/ml，0.1%柠檬酸钠，0.1%TritonX-100)，避光4℃过夜后上机检测[5]。
1.10 细胞DNA片段化分析
收集经p16基因、PCDNA3空质粒磷酸钙-DMSO转染后48小时的细胞，用DNAzol(GIBCO)试剂提取基因组DNA。乙醇沉淀后，用20μlTE溶解DNA，1%琼脂糖电泳。
1.11 统计学分析
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曲线之间的比较采用方差分析。各细胞周期分布的比较采用t检验。n值为各组实验数。
2 结果
2.1 表达p16基因的胶质瘤细胞系U251、SWO的长期稳定转染和筛选
用lipofectin脂质体转染的方法分别将经分光光度计定量后的等量PCDNA3-p16及空质粒转入SWO及U251细胞系，经500μg/mlG418的筛选。加药约7天后，大部分细胞死亡。14天后，转染PCDNA3空质粒的SWO、U251细胞组开始出现克隆，26天后，p16基因转染的两细胞组才开始有克隆形成，且p16基因转染组的克隆形成数目明显少于空PCDNA3质粒转染组。筛选5周后，从每株细胞中挑取2～4个克隆进行单克隆化，经Northern-Blotting检测筛选高表达克隆。
2.2 转染后外源p16基因的表达
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p16基因免疫组化示经p16基因磷酸钙-DMSO转染的细胞系阳性细胞数明显增多(图1)。图2示经G418筛选的长期稳定转染p16基因的U251细胞免疫组化呈强阳性，对照组呈阴性或弱阳性。Northern blotting分析示U251-p16与SWO-p16细胞p16基因表达水平明显高于对照组(图3)。
图1 磷酸钙-DMSO转染后P16基因的免疫组化(DAB显色,苏木素复染)
A.转染PCDNA3空质粒的U251对照细胞B.转染p16基因的U251细胞
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图2 U251细胞稳定转染筛选后的免疫组化(DAB显色，苏木素复染)
A.转染PCDNA3空质粒的U251对照细胞B.转染p16基因的U251-p16细胞
图3p16基因、PCDNA3空质粒转染后U251的
Northern blot分析
1:U251-p16;2:U251-p16；3:p16转染48h的U251;
4:U251-PCDNA3;5:U251
2.3 p16基因磷酸钙-DMSO转染后对胶质瘤细胞凋亡的诱导作用
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U251、SWO细胞经p16基因短暂转染48小时后，光镜下可见部分细胞变圆，部分细胞脱落死亡；对照组细胞无明显变化。行流式细胞仪分析，可见p16基因转染48小时后出现明显的亚G1峰(即凋亡峰)(图4)。提取该细胞DNA行琼脂糖电泳，发现有典型的DNA ladder现象。这些结果表明p16基因的短暂转染可诱导胶质瘤细胞U251、SWO的凋亡。同时行流式细胞仪细胞周期分析，其中，SWO细胞系各期分布无明显差异(P>0.05)(表1)。
图4SWO,U251细胞系p16基因磷酸钙-DMSO转染后流式细胞仪分析(PI染色)
A.SWO-PCDNA3;B.SWO-p16;E.U251-PCDNA3;H.U251-p16
表1 SWO细胞系p16基因磷酸钙-DMSO转染后
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流式细胞仪细胞周期分析(n=10，
±s) 细胞系G1期(%)
G2期(%)
S期(%)
SWO-PCDNA3
55.2±4.7
12.3±2.5
32.5±5.1
SWO-p16
58.0±6.2
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10.2±3.7
31.8±6.0
t检验，P>0.05
2.4 外源p16基因长期稳定表达对U251、SWO细胞的抑制作用
图5A、B分别显示U251-p16(+)和SWO-p16(+)与SWO、U251亲代及分别转染PCDNA3空质粒的SWO、U251细胞系相比，生长速度明显减慢。行流式细胞仪分析，可见p16基因转染的胶质瘤细胞系二倍体峰后细胞及四倍体细胞明显减少，无明显的亚G1峰(凋亡峰)。细胞周期分析提示p16基因转染后胶质瘤G1/G0期细胞比例明显增加(P<0.01)(表2)。
, http://www.100md.com 图5 A p16基因表达对脑胶质瘤细胞系U251生长的影响
图5 B p16基因表达对脑胶质瘤细胞系SWO生长的影响
(两细胞系的p16转染组与PCDNA3对照组及母细胞系组分别
从第五、六天始出现有统计意义的差异，F检验，P<0.01；PCDNA3
对照组与母细胞系组在实验全程的差异均无统计意义，F检验，P>0.05。n=12)
表2 U251细胞系p16基因长期稳定转染后
流式细胞仪细胞周期分析(n=10,
±s) 细胞系, 百拇医药
G1期(%)
G2期(%)
S期(%)
U251-PCDNA3
69.8±3.1
12.3±2.9
19.9±2.2
U251-p16
85.5±4.4
0.3±0.2
14.2±3.4
, 百拇医药 t检验，P<0.01
3 讨论
p16基因是目前脑胶质瘤研究中所发现的缺失率、突变率最高的基因。据统计，在目前所研究的胶质瘤细胞株中，p16缺失率达82%[1]，而在原发性脑胶质瘤中也高达71%[2]，充分显示了p16基因异常与脑胶质瘤发生发展的密切关系，并引起了人们的高度重视。目前认为，p16基因的主要作用是特异性的抑制细胞周期素D(cyclin D)-细胞周期素依赖性激酶(CDK)复合体，从而达到对细胞由G1期到S期的调控。当细胞由于某种原因p16基因缺失或失活，cyclin D-CDK复合体持续高活性的存在于细胞内，进而导致pRb基因的磷酸化，从而释放转录因子E2F等，从而激活其他细胞增殖相关基因，导致细胞从G1期到S期的不受控特性[6]。本实验将p16基因通过长期稳定转染导入胶质瘤细胞株U251、SWO，结果两者的生长速度明显减慢，肿瘤细胞被阻滞在G1/G0期，充分证实了野生型p16基因能抑制肿瘤生长，其缺失及突变可导致细胞的恶性增殖。但为什么在短暂转染后的细胞周期分析却无统计意义呢？我们认为，其主要原因在于短暂转染的转染效率问题。一般来说，普通磷酸钙转染的效率最高达10%[3]，当采用DMSO休克后，虽可使转染效率急剧升高，但也较难达到50%以上。因此，相当一部分细胞不被p16基因转染。当我们取P=0.05作为判别标准，在小样本情况下，有时难以获得有统计意义的结果。
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目前，有关p16基因与胶质瘤细胞凋亡的关系尚未见文献报道。我们认为，这可能与大多数研究者将研究重点放在p16基因的长期稳定转染进而研究p16基因对这些阳性克隆的作用有关。事实上，我们发现，p16基因的短暂转染与长期稳定转染的作用各有其不同侧重。p16基因短暂转染可诱导明显的细胞凋亡，但由于转染效率的限制，部分细胞系的G1/G0期阻滞不明显；而p16基因的长期稳定转染有明显的肿瘤细胞G1/G0期阻滞和细胞生长抑制，但无明显的细胞凋亡现象。这是一个饶有兴趣的问题。我们认为，p16基因的作用很可能不仅仅是特异性的抑制cyclin D-CDK复合体。在复杂的人体“基因网络”中，p16基因很可能能与其他基因相互作用，共同参与细胞凋亡调控等其他生命现象。单基因、单作用是不符合大多数生命现象调控本质的，尤其是真核高等生命。在这方面，Sandig等报道了与我们类似的结果[7]。他们发现，当p16基因与p53联合作用后，细胞凋亡发生率大大提高，他们认为，这是p16基因降低Rb的表达进而增加肿瘤细胞对凋亡敏感性的结果。同时，程金科等也发现，采用腺病毒载体将基因短暂转染黑色素瘤细胞可诱导明显的细胞凋亡[8]。然而，为什么会出现肿瘤细胞短暂转染与长期稳定转染的差异呢？我们知道，异质性是肿瘤尤其是恶性肿瘤的一个重要特点。它不仅表现在肿瘤细胞形态上，同时，由于肿瘤细胞的高度恶性增殖，更赋予肿瘤细胞在遗传学上的不稳定特点。即使在同一肿瘤细胞系或同一原发性肿瘤，在其恶性增殖过程中，最终它们的基因型不一定完全一致，这就是肿瘤细胞异质性的遗传学基础，也是临床病理上各种混合型肿瘤发生的原因之一。从进化论的角度来看，当p16基因转染入一个肿瘤细胞群体后，能被p16基因诱导凋亡的肿瘤细胞发生了凋亡，被“淘汰”；而不能被p16基因诱导凋亡的肿瘤细胞仍能继续存活下来，被“选择”，最终成为一个稳定整合p16基因的肿瘤细胞系，在这一“新”细胞系中，p16基因已不能发挥诱导细胞凋亡的作用但仍能发挥它的基本功能即：抑制cyclin D-CDK复合体、诱导肿瘤细胞的G1期阻滞。
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人体的基因调控是一个非常复杂的网络系统。p16基因也是如此。我们觉得，我们目前所了解的有关p16基因的作用与调控仍仅仅是沧海一粟。进一步深入胶质瘤p16基因研究并结合正常胶质细胞的p16基因研究将具有重大意义。p16基因的变化直接与人类50%～70%的胶质瘤患者密切相关，如何将单一基因置于复杂的基因网络中研究可能是我们的当务之急。也是我们未来基因研究的方向，当然，这一过程不是一蹴而就的，需要广大研究者的协作与共同努力。我们相信，随着人类对自身基因网络调控的深入了解，必将开辟肿瘤诊断、治疗的新局面，最终攻克肿瘤。
基金项目：本课题受国家自然科学基金(批准号:39700143)资助
通讯作者：徐如祥：Tel：86-20-85143622
Fax：86-20-84309130
E-mail：chenyizhao@163.net
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[参考文献]
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[3] 奥斯伯 F，金斯顿 RE，赛德曼 JG，等，编著.颜子颖，王海林，译.精编分子生物学实验指南[M].第一版.北京：科学出版社，1998：274.
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[4] 郝新保，张利朝.MTT 法测定细胞生长曲线[J]. 第四军医大学学报 ,1997,18(4)：190～191.
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[6] Peter B.Dirksk,JT.Rutka.Current concepts in neuro-oncology[J]. The cell cycle-A review.Neurosurgery,1997,40:1000～1014.
[7] Sandig V,Brand K，Herwig S,et al. Adenovirally transferred p16INK/CDK2 and p53 genes cooperate to induce apoptotic tumor cell death [J]. Nat Med,1997,3:313～319.
[8]程金科，林晨.腺病毒介导p16基因转移及诱导黑色素瘤细胞凋亡[J].中华肿瘤杂志,1999,21(2)：89～91.
收稿日期：1999-07-05；修回日期：1999-09-28, http://www.100md.com